BotulinSafe

Niet-toxische Clostridium botulinum stammen en hun bijdrage tot product- en procesinnovaties

Waarom dit project?

De vraag naar clean label producten blijft stijgen, en dat is niet anders voor kant-en-klare maaltijden. Dat maakt dat voedingsbedrijven moeten blijven inzetten op innovaties in bewaarmiddelen en het behandelen van voedingsproducten. In de vleeswarenindustrie gaat de aandacht bijvoorbeeld uit naar het vervangen van nitriet- en nitraatadditieven (bv. hun natriumzouten E 250 en 251) omwille van groeiende ongerustheid rond de gezondheidsaspecten van nitriet.

Dit mag echter niet ten koste gaan van de voedselveiligheid. Clostridium botulinum is daarbij wellicht de belangrijkste pathogene sporenvormer die in dergelijke producten onder controle moet gehouden worden. Enerzijds omdat nitriet een performant inhiberende werking tegen dit organisme heeft (EFSA 2003: 50-150 mg/kg nitriet essentieel) en anderzijds omdat er psychrotrofe stammen (die kunnen groeien bij lage temperaturen) van bestaan die een bijzondere bezorgdheid vormen voor koel bewaarde levensmiddelen. omdat ze zelfs bij lage temperaturen (> 3 °C) het botuline neurotoxine kunnen vormen. .

Er zijn dus gepaste product- en procesaanpassingen nodig om C. botulinum onder controle te houden. Op het vlak van nitraat- en nitrietvervanging zijn ‘label friendly’ alternatieven nodig die anticlostridiale activiteit vertonen. Op het vlak van processing dienen optimale procesparameters uitgezocht te worden in combinatie met complementaire productconditionering (pH, a_w, temperatuur, zoutgehalte, organische zuren, verpakkingsatmosfeer).

Om deze aanpassingen op hun effectiviteit tegen C. botulinum te beoordelen zijn challenge testen onontbeerlijk. Dit is echter voor C. botulinum niet zo evident: de klassieke challenge testen voor C. botulinum vereisen uitzonderlijke veiligheidsmaatregelen, specifieke (anaërobe) groeicondities en gespecialiseerd personeel. Bovendien bestaat er geen selectieve groeibodem voor C. botulinum, wat de betrouwbaarheid van plaattellingen niet ten goede komt.Een oplossing voor deze uitdaging is het gebruik van zogenaamde surrogaat C. botulinum stammen, die niet toxisch zijn maar in hun andere eigenschappen gelijken op de pathogene varianten.

Onderzoeksaanpak

BotulinSafe was een collectief onderzoeksproject (type VIS-CO), met als doel om, aan de hand van deze niet-toxische C. botulinum stammen:

Betrouwbare, vlot toegankelijke challenge testen voor C. botulinum op punt te stellen voor vier nitraat/nitriet-vrije model doelproducttype
‘Label friendly’ alternatieven voor nitriet- en nitraatadditieven te testen en valideren naar hun anticlostridiale activiteit toe
Procesparameters in combinatie met conditioneringscondities en hun impact op de controle van C. botulinum  per model doelproducttype te bepalen
De projectresultaten te vertalen voor implementatie naar industriële producten toe.

Het onderzoeksplan had volgende concrete doelstellingen:

Isolering en karakterisering van niet-toxische stammen die representatief zijn voor de diversiteit van C. botulinum,
Introducering van merkers in het genoom van de verschillende representatieve surrogaatstammen om een selectieve telling en dus een specifieke kiemgetalbepaling voor C. botulinum mogelijk te maken,
Demonstratie van de ‘proof-of-concept’ van het gebruik van gemerkte C. botulinum surrogaatstammencocktails voor challengestudies en in het onderzoek naar anticlostridiale strategieën in modelproducten,
Validatie van de anticlostridiale activiteit van natuurlijke antimicrobiële stoffen,
Validatie van de anticlostridiale activiteit en technologische inzetbaarheid van coagulase-negatieve stafylokokken (CNS) als startercultuur in gefermenteerde vleeswaren,
Aanbieden van een innovatieforum met het oog op het verder exploreren van de toepassingen van deze niet-toxische stammen.

Doelgroep en resultaten

Het project richtte zich tot (i) producenten van vleeswaren of kant-en-klaar maaltijden die innovatief ingesteld zijn of exporteren naar landen waar strenge voorwaarden gesteld worden aan C. botulinum-gerelateerde voedselveiligheidsrisico’s, (ii) ingrediëntenleveranciers en (iii) commerciële analytische laboratoria.

In het project werden tweeëntwintig niet-toxische groep I (proteolytische) en zestien niet-toxische groep II (niet-proteolytische) Clostridium botulinum stammen geïsoleerd uit stalen van diverse voedings- en milieubronnen. Deze collectie werd aangevuld met zestien niet-toxische stammen uit publieke en wetenschappelijke cultuurcollecties. Hun volledige genoom werd gesequeneerd (via ‘whole genome sequencing’, WGS). Op basis van genomische en fenotypische verwantschap met toxische Clostridium botulinum stammen, werden zes groep I en vijf groep II niet-toxische stammen geselecteerd om er stammencocktails mee samen te stellen die als surrogaatstammen voor toxische C. botulinum fungeerden. De geselecteerde stammen werden vervolgens ‘gemerkt’ met een erythromycine resistentiegen. Samen met hun natuurlijke resistentie tegen cycloserine en gentamicine, liet dit toe om hun groei selectief (m.a.w. in de aanwezigheid van achtergrond microbiota) en kwantitatief op een klassieke manier op te volgen met antibiotica bevattende telplaten.

Als demonstratie van een eerste toepassing van deze surrogaatstammen werden ze aangewend bij het in vitro testen van natuurlijke hittebestendige antimicrobiële componenten op mogelijke anticlostridialiteit. Vijf van de negen gescreende componenten werden geïdentificeerd als anticlostridiaal (o.b.v. hun lage MIC waarden). Toegepast in reële voedingsmatrices bleken hun anticlostridiale activiteiten echter veel lager te liggen, door interferentie/interactie met voedingscomponenten. Ook smaakafwijkingen vormen een aandachtspunt voor hun implementatie.

Een tweede toepassing van de surrogaatstammen die gedemonstreerd werd, betrof hun aanwending voor het identificeren van coagulase-negatieve stafylokokken (CNS) met anticlostridiale activiteit. Screening van een collectie van driehonderdtweeëndertig CNS stammen leverde één stam op (Mammaliicoccus sciuri IMDO-S72) die in staat bleek om de groei van alle geteste C. botulinum stammen te inhiberen. Verder onderzoek toonde aan dat deze stam het bacteriocine ‘micrococcin P1’ produceerde. In challengetesten waarbij groep I C. botulinum surrogaatstammen werden ingezet in een nitraat- en nitrietvrij salami bereidingsproces, met Mammaliicoccus sciuri IMDO-S72 (al of niet samen met Latilactobacillus sakei) als startercultuur, kon geen antagonistische activiteit vastgesteld worden omdat C. botulinum zich onder geen van de geteste bereidingsscenario’s kon profileren.

Als derde toepassing werd de aanwending van de surrogaatstammen voor C. botulinum challengetesten (provocatietesten) van voedingsproducten onderzocht. Inoculatie gebeurde in deze testen steeds met sporen en op/of in de bereiding van nitraat/nitriet-vrije voedingsproducten. In condities en op producten waar er, in de loop van de houdbaarheidstesten, groei optrad met groep II C. botulinum surrogaatstammen bleek de sporenkieming op de selectieve telplaten echter in zekere mate geïnhibeerd te worden waardoor geconcludeerd moest worden dat de challengetest voor groep II C. botulinum niet tot kwantitatief betrouwbare resultaten leidt. Een evaluatie door een commercieel analytisch laboratorium leverde enkele aanbevelingen op om het protocol voor de challengetesten dichter bij praktijktoepassing te kunnen brengen.

Het project leverde 4 Flanders’ FOOD Radar artikels, 4 publicaties in wetenschappelijke tijdschriften en 2 doctoraten op.

Projectpartners

Flanders’ FOOD beheerde en coördineerde het project.
De experimentele uitvoering was in handen van:

De onderzoeksgroep voor Levensmiddelen- en Microbiële Technologie van de KU Leuven onder leiding van Prof. Chris Michiels
De onderzoeksgroep voor Industriële Microbiologie en Voedingsbiotechnologie van de VUB onder leiding van Prof. Frédéric Leroy
De onderzoeksgroep voor Technologie en Kwaliteit van dierlijke producten van de KU Leuven onder leiding van Prof. Ilse Fraeye
De onderzoeksgroep voor Levensmiddelenmicrobiologie en -conservering van UGent onder leiding van Prof. Frank Devlieghere

Deelnemen

Het project liep van 1 april 2018 tot 30 juni 2022. Mits betaling kunnen de projectresultaten opgevraagd worden. Voor meer info kan u contact opnemen met de projectbeheerder.