Voedselallergenen detecteren

Voedselallergie is een sterk opkomend probleem. In dat kader is er voornamelijk nood aan technieken die allergenen kunnen detecteren die onbedoeld aanwezig kunnen zijn in levensmiddelen. Een aantal Belgische onderzoekers onderzochten alvast de mogelijkheden van immunologische, chromatografische en celfunctionele methoden.

Voedselallergenen

In onze westerse samenleving zijn 3 à 4% van de volwassenen en tot 8% van de kinderen allergisch voor één of meerdere voedingsstoffen. De allergische reacties worden veroorzaakt door specifieke proteïnen die allergenen genoemd worden. Bij gebrek aan een medische behandeling moeten allergiepatiënten de voor hun relevante allergenen mijden, en dit vaak hun hele leven lang. Voor hen is het dus essentieel om de ingrediëntsamenstelling van voedingsmiddelen te kennen. Voor voorverpakte voedingsproducten is het declareren van de aanwezigheid van allergene voedingsingrediënten via het etiket bij wet verplicht. Deze verplichting geldt in het bijzonder voor 14 bronnen van allergenen die opgelijst werden in EU Richtlijnen 2003/89/EC en 200/68/EC. Deze zijn:

  • Glutenbevattende granen (d.w.z. tarwe, rogge, gerst, haver, spelt en kamut of de hybride soorten daarvan) en producten op basis van glutenbevattende granen
  • Schaaldieren en producten op basis van schaaldieren
  • Eieren en producten op basis van eieren (kippe-eiwit)
  • Vis en producten op basis van vis
  • Aardnoten (pindanoten) en producten op basis van aardnoten
  • Soja en producten op basis van soja
  • Melk en producten op basis van melk (inclusief lactose)
  • Schaalvruchten, d.w.z. amandelen, hazelnoten, walnoten, cashewnoten, pecannoten, paranoten, pistachenoten, macadamianoten en producten op basis van schaalvruchten
  • Selderij en producten op basis van selderij
  • Mosterd en producten op basis van mosterd
  • Sesamzaad en producten op basis van sesamzaad
  • Zwaveldioxide en sulfieten in concentraties van meer dan 10 mg/kg of 10 mg/l uitgedrukt als SO2.
  • Lupine en producten op basis van lupine
  • Weekdieren en producten op basis van weekdieren

Toch lopen allergiepatiënten het risico om onvermoed allergenen te consumeren. Immers, allergenen kunnen onbedoeld in voedingsproducten terecht komen via bijvoorbeeld gecontamineerde grondstoffen, een slecht reinigingsproces of door kruiscontaminatie tijdens transport en opslag. Aangezien deze ‘verdoken’ allergenen in zeer kleine hoeveelheden voorkomen en in complexe voedingsmatrixen, is er nood aan gevoelige, robuuste methoden om allergenen te kunnen detecteren en kwantificeren. Op een recent seminarie werden drie Contractuele Onderzoeksprojecten van DG Dier, Plant en Voeding over dit thema toegelicht.

Allergenen detecteren met ELISA kits

Er bestaan verschillende commerciële kits die allergene voedingsstoffen kunnen detecteren op basis van immunochemische reacties. Het gaat hierbij voornamelijk over ELISA testen: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays (Figuur 1).


Figuur 1: Typisch beeld van een ELISA test in een microtiterplaat. Hier wordt de analyse van 48 stalen getoond. De stalen waarin allergenen zitten kleuren paars. Hoe meer allergeen aanwezig, des te intenser de kleur.

De resultaten van deze kits vallen onderling echter moeilijk te vergelijken want elke kit gebruikt zijn eigen standaardreferentie en protocol. Eén van de onderzoeksprojecten valideerde verschillende detectiekits voor melk (caseïne en beta-lactoglobuline), ei (eiwit proteïnen, ovomucoïde) en gluten (gliadine) aan de hand van welbepaalde standaarden (respectievelijk melkpoeder NIST RM 1549, eipoeder NIST RM 8445 en tarwegluten G5004 van Sigma) en een geharmoniseerd protocol.

Allergenen detecteren met ELISA

In deze testen worden allergenen gedetecteerd via binding met een specifiek antilichaam. De aldus gevormde allergeen/antilichaam complexen worden vervolgens ‘zichtbaar’ gemaakt via binding met enzym-gelinkte secundaire antilichamen. De hierbij gebruikte enzymen zijn immers in staat om een kleurstof te doen ontstaan door omzetting van specifieke chemicaliën (bv. oxidatie van TMB door peroxidase).

Om de hoeveelheid te bepalen worden van tevoren verdunningen met bekende concentraties van de het allergeen gemaakt en tevens verdunningen van het monster. Omdat de hoeveelheid signaal evenredig is met de hoeveelheid enzym, kan bepaald worden wat de concentratie in het monster is.


De grenzen van bepaalbaarheid (LOQ) van de kits voor verschillende voedingsmatrixen werden bepaald (bv. koekjes, pasta, fondant chocolade,…) en vervolgens werd er een ringonderzoek gestart waaraan een 7-tal laboratoria meewerkten. Zij kregen koekjes (al dan niet verrijkt met eipoeder, caseïne en beta-lactoglobuline), fondant chocolade (al dan niet verrijkt met caseïne en beta-lactoglobuline) en pasta (al dan niet verrijkt met eipoeder) ter analyse met behulp van de kits. De resultaten toonden aan dat er heel wat variatie zat op de kwantitatieve analyses. Er werden nogal wat onderschattingen en overschattingen genoteerd. De beste resultaten werden voor alle kits bekomen voor de detectie van beta-lactoglobuline in fondant chocolade. Eén kit scoorde goed voor het bepalen van eipoeder in koekjes en pasta. De bepalingen van caseïne bleken het minst correct.

Voor meer info over de resultaten van dit onderzoekproject, contacteer:p.delahaut@cergroupe.be.

Allergenen detecteren met massaspectrometrie

Voor het kunnen detecteren van allergenen rond 1 ppm hoeveelheden komen massaspectrometrische (MS) methoden in aanmerking. Voordeel van deze technologie is dat allergenen rechtstreeks geïdentificeerd en gekwantificeerd kunnen worden. Analyse van allergene proteïnen blijkt het best te lukken op peptiden. Deze kunnen bekomen worden via een behandeling met Trypsine. De identificatie en kwantificatie van het allergeen is daarmee ook onafhankelijk van de 3D structuur van het allergeen. Kwantificatie gebeurt aan de hand van isotopisch gelabelde versies van het allergeen peptide die in een gekende hoeveelheid wordt toegevoegd. De MS signaal intensiteiten van het te analyseren allergeen worden dan vergeleken met die van de referentie.

Massaspectrometrie

In een massaspectrometer worden individuele moleculen van het monster geïoniseerd en vervolgens ruimtelijk gescheiden op basis van hun massa/ladingsverhouding (m/z) waarna de detectie volgt. In een massaspectrum worden de m/z waarden uitgezet tegen de intensiteit.


In een onderzoeksproject werd deze benadering met succes uitgetest voor het detecteren van sporen van de allergenen melk, eieren, hazelnoten en soja in voedingsproducten. Target allergene proteïnen waren respectievelijk beta-lactoglobuline, ovalbumine, 11S globulin-like proteïne (Cor a 9) en beta-conglycinine. Voor elk van deze werd het optimaal detecteerbare peptide bepaald .

Voor meer info over de resultaten van dit onderzoekproject, contacteer:e.depauw@ulg.ac.be.

Allergenen detecteren met een celfunctionele test

Voor de meest gevoelige allergiepatiënten kunnen de kleinste hoeveelheden allergeen reeds grote gevolgen hebben. Dit is bijvoorbeeld het geval voor mensen die gevoelig zijn aan zowel Ara h 2, Ara h 1 en Ara h 3 pindanoot allergenen. Detectie van minieme hoeveelheden allergenen blijkt mogelijk te zijn door gebruik te maken van zogenaamde basofiele cellen die aanwezig zijn in het bloed van deze hypergevoelige patiënten. Voordeel van deze test is verder dat het een functionele test is die rechtstreeks en enkel de aanwezigheid van biologisch actieve allergene proteïnen zelf aantoont.


Patiënten testen op allergie

De meest rechtstreekse methode om allergie te testen is de provacatie test waarbij de patiënt wordt blootgesteld aan stapje voor stapje toenemende dosissen van allergeen . Er zijn zowel praktische nadelen als ethische bezwaren tegen deze aanpak. Een alternatief is de huidtest maar deze is moeilijk te standaardiseren en onaangenaam voor de patiënt. In vitro testen winnen daarom meer en meer aan belang. Men kan basofiele cellen (een soort witte bloedcel) uit het bloed van patiënten halen en deze in contact brengen met allergenen. In geval van een allergische reactie zullen deze basofiele cellen histamine vrijstellen en zullen er CD63 merkers op de buitenkant van deze cellen verschijnen. Dit principe vormt de basis van een basofielen activatietest.


Via deze basofielen activatietest werd in een onderzoeksproject aangetoond dat de aanwezigheid van 0,01 ppm pindanoot (gestandaardiseerde mix) in koekjes en chocolade gedetecteerd kon worden (30% van de basofiele cellen werd geactiveerd). Aanwezigheid van 0,1 ppm leidde vanzelfsprekend tot een grotere activatie (50% van de basofiele cellen werd geactiveerd).

Processing van pindanoten (roosteren of blancheren) leidde in sommige gevallen tot een sterke vermindering van de activatie van basofiele cellen van bepaalde patiënten. Doch, basofiele cellen van andere patiënten vertoonden verrassend een verhoogde activatie. Kortom er bestaan sterke individuele verschillen in de reactie van hypergevoelige allergie patiënten op geproceste allergenen.

Voor meer info over de resultaten van dit onderzoekproject, contacteer: didier.ebo@ua.ac.be.

Nuttige Links

Bron

Chemische veiligheid van de voedselketen: recente wetenschappelijke ontwikkelingen, 2ejaarlijks symposium Contractueel Onderzoek – FOD Volksgezondheid, Veiligheid van de Voedselketen en Leefmilieu – Directoraat-generaal Dier, Plant en Voeding, 24 november 2009, CODA, Tervuren