De nieuwe technologie van Innosieve Diagnostics combineert filtratie met microzeven met de analyse door een op LED-gebaseerde optische techniek. De experimentele procedure laat een vrijwel onmiddellijke detectie en nauwkeurige kwantificatie en kwalificatie toe van levende en dode bacteriën zonder noodzakelijke tijdconsumerende labotechnieken als bacteriële aanrijking en uitplaten.
Snelle detectie van pathogenen in voeding is geen eenvoudige zaak. Enerzijds komen ze slechts voor in zeer lage concentraties en zijn de normen zeer strikt, anderzijds is voeding een zeer complexe matrix. Door de nood aan aanrijking van de pathogenen te elimineren en deze stap te vervangen door een opconcentratie van de aanwezige bacteriën claimen de onderzoekers een kwantitatieve detectie op een veel kortere periode in vergelijking met de courant gebruikte methoden. (Figuur 1)
Figuur 1: Vergelijkend overzicht van de verschillende detectiemethoden voor Salmonella.
Werkingsprincipe
In eerste stap wordt de voedingsmatrix herleid tot een suspensie. Door de suspensie met een zeef met uniforme microporiën te filteren blijven de grotere deeltjes achter op de microzeef. Vervolgens worden door middel van pathogeenspecifieke antilichamen de bacteriën gelabeld met fluorescente markers. Een automatische optische scanner toont tenslotte de aanwezige pathogenen.
Staalvoorbereiding
Om verstopping te vermijden dient de suspensie vrij te zijn van precipitaten en grote partikels. De staalvoorbereiding is bijgevolg zeer belangrijk en afhankelijk van de voedingsmatrix.
Microfiltratie
Microzeven kunnen gemaakt worden met technologieën uit de micro-elektronica. Hierdoor hebben ze een aantal voordelen ten opzichte van andere filtermembranen. Ze zijn te maken met zeer uniforme poriën, een hoge porositeit en extreem dun (0.5 tot 5µm). (Figuur2)Hierdoor is er ondanks de kleine poriën slechts een zeer lage druk (0 tot 0.5 MPa) nodig om de suspensie te filteren.
Mits de suspensie voldoende zuiver is en de zeef de juiste poriëngrootte heeft, kan in theorie elke CFU weerhouden en later gedetecteerd worden. Het systeem is dus per definitie kwantitatief: wat erin zit, komt op de zeef, met een hoge nauwkeurigheid en dus weinig spreiding.
Figuur 2: (links) Voorbeeld van de microzeef. (recht)Poriëndistributie van een microzeef in vergelijking met andere filtermembranen.
Kleuring
De zeef wordt gewassen en gespoeld met pathogeenspecifieke antilichamen en fluorescent gelabelde antilichamen. Op deze manier worden de te detecteren pathogenen fluorescent gelabeld. (Figuur 3)
Figuur 3: Antilichamen binden op specifieke bindingsplaatsen op Salmonella bacteriën. Antilichamen met fluorescerende markers binden op de Salmonella-specifieke antilichamen.
Detectie
De weerhouden deeltjes na filtratie worden rechtstreeks op de microzeef gedetecteerd. Met behulp van de µscan, een LED-gebaseerde optische scanner, wordt op 4 minuten de volledige oppervlakte geanalyseerd. Gefilterd LED licht wordt geabsorbeerd door de fluorescente moleculen en deze zenden een groen-geel licht uit dat terug wordt opgevangen. (Figuur 4) Op deze manier zijn fluorescent gelabelde pathogenen te onderscheiden van andere deeltjes en bacteriën die op de microzeef zijn achtergebleven. (Figuur 5)
Figuur 4: (links) De µscan. (rechts) Werkingsmechanisme: Van een lichtbron, hier LEDs, wordt door een filter licht met een bepaalde golflengte geselecteerd. Dit licht wordt geabsorbeerd door de fluorescerende molecule (1). De opgenomen energie brengt elektronen in een hoger energieniveau (2) (excitatie). Bij terugvallen naar het oorspronkelijke energieniveau wordt licht uitgezonden met een lager energieniveau en dus groter golflengte (3) (emissie).
Figuur 5: Detectie van Salmonella bacteriën via Salmonella specifieke antilichamen met fluorescerende markers. Van alle weerhouden deeltjes (links) worden enkel de Salmonella bacteriën zichtbaar me de µscan.
De bacteriën kunnen zowel destructief als niet-destructief van de zeef verwijderd worden, zodat bijvoorbeeld uitplaten nog steeds mogelijk is. Ook kan er gekozen worden voor een directe DNA extractie na opconcentratie van de micro-organismen op de microzeef.
Verder onderzoek
Om de microzeefgebaseerde detectie van verschillende pathogene micro-organismen zoals Salmonella, Listeria, Campylobacter en Legionella verder te optimaliseren is Innosieve Diagnostics samen met andere partners dit jaar een Europees EuroTransBio project gestart. Er ligt een sterke nadruk op de staalvoorbereiding van verschillende voedingsmatrices als water, kip, vlees en kaas. Het is de bedoeling de ontwikkelde testen tegen het eind van het project te valideren d.m.v. een ringtest gebruikmakend van verschillende voedingsproducten en t.o.v. de ‘gouden standaard’ methode.
Het is de verwachting dat Innosieve Diagnostics BV de verschillende testkits en de µscan commercieel beschikbaar brengt vanaf de 2e helft van 2009.
Bronnen
- www.innosieve.com
- www.eurotransbio.net
- www.microfiltration.nl
- www.ccm.nl