Alles over Pathogene sporenvormers

Artikels over Pathogene sporenvormers

  • Een veilige challenge test voor Clostridium botulinum dankzij atoxigene mutanten
    15 03 2017

    CLOSTRIDIUM BOTULINUM

    Clostridium botulinum is een Gram-positieve, anaërobe sporenvormende, staafvormige bacterie die potentieel het botuline neurotoxine  kan produceren. Dit micro-organisme is in de natuur terug te vinden in zuurstofarme milieus (bodemsedimenten met rottend organisch materiaal, slik van waterlopen,…). Zijn sporen kunnen accidenteel voedingsproducten contamineren. Wanneer deze niet geëlimineerd worden door aangepaste processing en/of hun uitgroei onvoldoende verhinderd wordt, leidt dit tot voedselgerelateerd botulisme: een uitzonderlijk, maar een ernstig klinisch syndroom met verlammingsverschijnselen.

    Historisch gezien is de aandacht vooral uitgegaan naar mesofiele Clostridium botulinum stammen (die geklasseerd worden onder ‘Groep I’, met optimale groei bij 35° tot 40° C), waarbij men vooral beducht is voor de hitte-resistente sporen die ze produceren. Om de voedselveiligheid te garanderen werd decenia geleden de ‘botuline-kook’ ontwikkeld (121°C gedurende 3 min, of equivalente letaliteit) die toegepast wordt bij het inblikproces van zwak-zure voedingsproducten (pH ≥ 5). Met de opkomst van milder geproceste en (vacuüm en MAP verpakte) koelverse voedingsproducten (om aan de consumentenwensen te beantwoorden) dient evenwel een andere groep van Clostridium botulinum stammen onder controle gehouden te worden. Namelijk deze van ‘Groep II’, welke psychrotroof zijn (minimale groeitemperatuur 3°C) en toxine kunnen produceren bij koelkasttemperaturen. Hun sporen zijn wat minder hitte-resistent en richtlijnen om het risico voor deze producten te beperken, kwamen in een eerder Food Radar artikel aan bod (december 2008).

    CHALLENGE TESTEN

    Microbiologische challenge testen zijn een middel om na te gaan of er groei of inhibitie optreedt van kiemen en pathogenen in voedingsmiddelen. Dergelijke testen worden gebruikt om de voedselveiligheid na te gaan van nieuwe producten, producten waarvan de samenstelling substantieel gewijzigd wordt (bv. concentratieverlaging of vervanging van bewaarmiddelen) evenals van aangepaste of nieuwe conserveringsprocessen (bv. hoge hydrostatische druk, pulsed electric field). Het uitvoeren van dergelijke testen met toxine-producerende micro-organismen dient te beantwoorden aan de strengste normen op het vlak van bioveiligheid en bioterrosrisme. Voor anaërobe micro-organismen komt daar nog bij dat er in zuurstofloze omstandigheden gewerkt dient te worden, wat een gespecialiseerde aanpak vraagt. Deze testen zijn dus niet vanzelfsprekend. Gezien het toenemende belang van 'Groep II' Clostridium botulinum stammen is er nood aan dergelijke challenge testen. Maar de specificaties en restricties vormen een belemmering om deze grootschalig te gaan toepassen. Niet-toxische mutanten, waarmee veilig gewerkt kan worden en die in hun eigenschappen zo goed als volledig gelijken op toxine-producerende Clostridium botulinum stammen zouden hier verandering in kunnen brengen.

    NIET-TOXISCHE (ATOXIGENE) CLOSTRIDIUM BOTULINUM MUTANTEN

    Het botuline toxine is een 150-kDa proteïne met een zink-afhankelijke endopeptidase werking. In het genoom van Clostridium botulinum wordt het gecodeerd door het 'bont' gen. Afhankelijk van de Clostridium botulinum stam codeert dit gen voor één van de zeven typen (A, B, C, D, E, F and G) botuline (waarvan enkel A, B, E en F menselijk botulisme veroorzaken). In sommige Clostridium botulinum stammen zijn meerdere toxinegenen aanwezig, en zij produceren dan verschillende botuline types. Voor groep II stammen zijn echter nog nooit meerdere toxinegenen in één stam aangetoond. Er zijn van-nature niet-toxische Clostridium mutanten gevonden, waarin het toxinegen niet aanwezig is. Doch deze bleken geen volmaakt ‘surrogaat’ organismen te zijn voor toxine producerende Clostridium botulinum stammen omdat bepaalde van hun eigenschappen (vooral van hun sporen) significant verschillen. Daarnaast is tot op heden niet duidelijk hoe genetisch verwant deze stammen zijn met Clostridium botulinum, waardoor het gedrag van deze niet-toxische stammen moeilijk voorspeld kan worden in condities die nog niet getest werden.

    Een alternatief is om, met behulp van recente gentechnologische ‘tools’, niet-toxische mutanten te creëren door in toxine producerende Clostridium botulinum stammen het bont gen in het genoom uit te schakelen. In een recent artikel rapporteerden Clauwers et al. (2016) hoe ze dit via twee strategieën voor elkaar kregen: door enerzijds een DNA insertie in het bont gen en anderzijds een uitwisseling van het bont gen met een Erythromycine resistentiegen (zie kader). Beide strategieën slaagden in hun opzet om het bont gen uit te schakelen. De eerste strategie heeft evenwel als nadeel dat er een risico is dat het insert zichzelf spontaan verwijderd (omwille van zijn ‘mobiele’ eigenschap) en dus de toxine status zich terug herstelt, terwijl de tweede strategie het voordeel biedt dat het bont gen volledig verwijderd is uit het genoom en de Erythromycine resistentie ervoor zorgt dat men zeer makkelijk selectieve plaattellingen kan uitvoeren. 

    EIGENSCHAPPEN VAN NIET-TOXISCHE CLOSTRIDIUM BOTULINUM MUTANTEN

    Groei eigenschappen van de atoxigene mutanten onder optimale en stress condities, evenals sporulatie efficiëntie bleken niet aangetast (behoudens een klein verschil in groei bij 2.3% NaCl). Ook de hitte resistentie van de sporen was vergelijkbaar met die van wild type Clostridium botulinum NCTC 11219 op een klein verschil in resistentie bij 70°C na (Figuur 1).

     

    Figuur 1 Hitte inactivatie van sporen van de mutanten en wild type Clostridium botulinum NCTC 11219, bij 70°C en 73°C, uitgedrukt in decimale reductie tijden (D70 en D73).

     

    BRONNEN:

    - Clauwers C., Vanoirbeek K., Delbrassinne L., Michiels C.W. (2016). Construction of nontoxigenic mutants of nonproteolytic Clostridium botulinum NCTC 11219 by insertional mutagenesis and gene replacement . Appl. Environ. Microbiol. 69: 4029-4036.

    - Preventie en snelle detectie van Clostridium botulinum. Food Radar Artikel, 11 december 2008.

  • Bacteriële sporenvormers alomtegenwoordig
    13 10 2011

    Bacillus cereus en Clostridium botulinum zijn voor de voedingsindustrie de meest beruchte pathogene sporenvormers. Deze micro-organismen kunnen toxinen produceren en hitteresistente sporen vormen die milde pasteurisatieprocessen overleven. Inactivatie van Clostridium botulinum vormt zelf de basis van de klassieke sterilisatie.

    De laatste jaren wordt duidelijk dat voor sommige producten ook best rekening gehouden wordt met andere bacteriële sporenvormers. Niet alleen voedselveiligheid blijkt een issue. Minder bekende pathogene sporenvormers zijn bijvoorbeeld Clostridium perfringens en Clostridium difficile. Bepaalde sporenvormers blijken ook verantwoordelijk te zijn voor het onverwacht optreden van bederf dat bovendien moeilijk controleerbaar is.

    UHT behandelde en gesteriliseerde melkproducten

    Bepaalde hitteresistente sporen kunnen de extreme condities van UHT en sterilisatieprocessen overleven. Een bekend voorbeeld is Bacillus sporothermodurans maar er zijn ook andere soorten die hiertoe in staat zijn. Tijdens bewaring kunnen de hitteresistente sporen ontkiemen en zelfs uitgroeien in producten die een hoge hittebehandeling hebben ondergaan. Dit kan leiden tot bederf van dergelijke producten met grote economische en imago schade tot gevolg.

    Gepasteuriseerde en gesteriliseerde soepen en sauzen

    Ook in gepasteuriseerde en gesteriliseerde soepen en sauzen gebeurt het soms dat bepaalde vormen van sporenvormende bacteriën het verhittingsproces overleven en uitgroeien in het product. Enkele voorbeelden hiervan zijn Bacillus subtilis, Bacillus sporothermodurans en Bacillus coagulans.

    Vruchtensap

    In de vruchtensappenindustrie kunnen sporen van Alicyclobacillus acidoterrestris een standaard pasteurisatie (92°C /10 seconden) overleven. In tegenstellingen tot vele andere micro-organismen kunnen alicyclobacilli uitgroeien in vruchtensap omdat ze acidofiel zijn en een pH tussen de 2,5 tot 6,0 verdragen. Bij bederf wordt vaak de volatiele metaboliet guaiacol gevormd die een typische ontsmettingsmiddelachtige geur en/of smaak geeft.

    Vacuüm verpakt vers vlees

    Clostridium estertheticum en Clostridium gasigenes zijn voorbeelden van de zogenaamde ‘Blown Package Spoilage Clostridia’. Deze sporenvormers worden gevreesd door vleesproducenten vanwege de snelheid waarmee ze vacuüm verpakt vlees kunnen bederven. Het zijn echte psychrotolerante of psychrofiele bacteriën die kunnen uitgroeien bij lage temperaturen, sommige zelfs nog bij -1°C. Karakteristiek voor ‘Blown Package Spoilage Clostridia’ is de enorme hoeveelheid gas die gevormd kan worden en aanleiding kan geven tot zogenaamde ‘bombage’ van de verpakking. Daarnaast kunnen ze ook off-flavours produceren zoals bepaalde zuren (azijnzuur, boterzuur) en solventen (butanol, ethanol). Eén spore kan genoeg zijn om vacuüm verpakt vlees ver vóór het verstrijken van de houdbaarheidsdatum te bederven waardoor deze sporenvormers zeer onvoorspelbaar en moeilijk controleerbaar zijn.

    Andere voedingsproducten

    De trend naar mildere hitte-behandelingen, in combinatie met meestal gekoelde bewaring heeft er toe geleid dat psychrotrofe sporenvormers zeer belangrijke determinanten worden voor de veiligheid en microbiële stabiliteit van verschillende koelverse producten. In het Flanders’ FOOD project MILDHEAT worden bederfsporenvormers in kaart gebracht en wordt een inschatting gemaakt van de belangrijkheid van deze sporenvormers voor bederf en houdbaarheid. Daarnaast wordt geanalyseerd in welke mate diverse factoren, tijdens de verhitting en tijdens de bewaring, de snelheid van kieming beïnvloeden. Er wordt ondermeer gekeken naar de invloed van de verhittingsintensiteit en de impact van intrinsieke (bv pH, aw) en extrinsieke factoren (bewaartemperatuur, gassamenstelling) op de ontkiemingssnelheid van bederfveroorzakende sporen en de daaropvolgende uitgroei.

    Bronnen

  • Plasma inactiveert zowel cellen als sporen

    In de micro-elektronica en de automobiel industrie worden plasma’s al een tijd gebruikt in industriële applicaties. Temperaturen van dergelijke plasma’s lopen op tot duizenden graden Celsius. Recent zijn er ook toepassingen van lage temperatuur plasmatechnologie. Het steriliseren van oppervlaktes medisch, farmaceutische en ‘food-contact’ materiaal of het verwijderen van desinfectie chemicaliën van hittegevoelige kunststoffen gebeurt bij lage temperaturen. Ook in de voedingssector komen er mogelijks applicaties als alternatief voor ‘traditionele’ thermische pasteurisatie en sterilisatie. Net zoals bij hoge hydrostatische druk of ‘pulsed electric fields’ worden micro-organismen bij plasmatechnologie in een kortdurende behandeling geïnactiveerd bij kamertemperatuur of licht verhoogde temperaturen wat de kwaliteit ten goede komt


    Plasma?

    Plasma is een fase van materie die gedeeltelijk of volledig geïoniseerd gas bevat met een netto neutrale lading. Er wordt vaak naar gerefereerd als de vierde aggregatietoestand omdat plasma eigenschappen heeft van gassen en van vloeistoffen. Een neutraal gas zoals stikstof, zuurstof of CO2 kan omgezet worden in plasma door het introduceren van energie. Dit resulteert in een mengsel van elektronen, ionen, radicalen en stralen van variabele golflengtes, inclusief golflengtes binnen het UV bereik.


    Inactivatie van micro-organismen

    De effectiviteit van plasma bij de inactivatie van micro-organismen op inerte oppervlaktes hangt sterk af van het design van de plasma generatoren en van de gebruikte condities (type gas, flow snelheid en druk). Ook de opgewekte UV stralen zijn verantwoordelijk voor de inactivatie. Verschillende studies tonen aan dat lage temperatuur plasma zeer effectief is tegen microbiële cellen en sporen op oppervlaktes en kunnen resulteren in >4 log reducties. Bij koude plasmatechnologie krijgen de UV straling, de radicalen en de reactieve species in het plasma gemakkelijker toegang bij oneffenheden. Hierdoor zijn er minder limitaties dan bij gepulseerd UV licht, een andere microbiële inactivatie technologie, waar schaduweffecten kunnen optreden (bv oneffen oppervlaktes).

    Welke producten?

    Droge voedingsproducten zoals kruiden en specerijen kunnen gecontamineerd zijn met microbiële sporen. Voor de inactivatie van de sporen zijn commercieel geschikte behandelingen beschikbaar maar het gebruik is beperkt doordat ethyleen oxide gassen gebannen worden en door de negatieve perceptie bij de consument omtrent gamma irradiatie. Producten met een laag vetgehalte, waarbij blootstelling aan UV en radicalen een minimale impact hebben op oxidatie of andere chemische veranderingen, lijken het best geschikt om te behandelen met koude plasma technologie.

    Plasma voor betere bewaring van groenten en fruit

    Een R&D consortium van Duitse onderzoekers en bedrijven zijn recent gestart met een project FriPlas. Hierin wordt nagegaan in welke mate koude plasmatechnologie ingezet kan worden bij de desinfectie van groenten en fruit na de oogst. Het consortium verwacht dat zowel de kwaliteit als de veiligheid van verschillende verse producten met plasmatechnologie sterk verbeterd kan worden. In het project zal het potentieel voor de verlenging van de houdbaarheid van bederfbare verse producten zoals aardbeien, kersen en sla maar ook van bewaarbare producten zoals wortel, appel en noten experimenteel nagegaan worden.

    Bronnen

    • Advances in innovative processing technologies for microbial inactivation and enhancement of food safety – pulsed electric field and low-temperature plasma ; Trends in Food Science & Technology 414-424; Jason Wan, John Coventry, Piotr Swiergon, Peerasak Sanguansri, Cornelis Versteeg
    • Friplas http://www.atb-potsdam.de
  • Nieuwe efficiënte manier voor afdoden van sporen
    28 06 2006

    Dit volgt uit onderzoek uitgevoerd door de Ohio State University in de Verenigde Staten. De experimenten werden uitgevoerd op een eierpastei waaraan sporen van Bacillus amyloliquefaciens werden toegevoegd. De pastei werd op verschillende temperaturen verhit (95 °C, 105 °C, 110 °C). Bij elk temperatuur werd een druk gebruikt van 0,1 (=controle), 500, 600 en 700 MPa. De resultaten (tabel 1) tonen aan dat bij hogere druk de sporen in veel kortere tijd gedood worden. Omdat bij de toegepaste druk zonder verhitting er nauwelijks sporen worden afgedood, spreekt men van een synergie tussen druk en temperatuur.

    Tabel 1: Effect van gecombineerde temperatuur / druk behandeling van eierpastei waaraan sporen van Bacillus amyloliquefaciens werden toegevoegd.

    Druk (MPa)

    Temperatuur

    D-waarde*

    0,1

    95

    349

     

    105

    24

     

    110

    5,9

    500

    95

    11,6

     

    105

    2,9

     

    110

    1,6

    600

    95

    1,8

     

    105

    0,7

     

    110

    0,5

    700

    95

    0,8

     

    105

    0,3

     

    110

    0,2

    * D-waarde: tijd in minuten om het aantal sporen met een factor 10 te inactiveren

    Er moet wel opgemerkt worden dat er in het onderzoek niet nagegaan werd of er door de verhoogde druk een adiabatische temperatuursverhoging opgetreden is. Hierdoor is het voor de hand liggend dat de gevonden D-waarden lager zijn.

    Het effect dat door deze onderzoekers gevonden werd, werd in het Flanders’ FOOD project 'Verlenging van microbiologische houdbaarheid' verder uitgediept. Er wordt met de studie beoogt om een grondige en geïntegreerde studie te maken van de mogelijkheden van Hoge Hydrostatische Druk behandeling als milde conserveringsmethode voor houdbaarheidsverlenging van minimaal behandelde levensmiddelen. Hierbij zal niet enkel aandacht uitgaan naar de microbiologische kant van de behandeling, hoewel er uiteraard wel de nadruk op ligt, maar zal tevens nagekeken worden of ook de nutritionele en sensorische kwaliteit van de producten behouden blijven.

    Bronnen

    Nieuwsbrief Voedselveiligheid

    Journal of Food Protection, 2006, 69, 853-860

Projecten over Pathogene sporenvormers